Mécanismes moléculaires de la réplication de l’ADN.

L’observation quotidienne du monde qui nous entoure fait ressortir l’immense diversité des êtres vivants, des végétaux aux animaux. Sous cette apparente diversité se cache en réalité une fascinante unité dans le fonctionnement intime des cellules vivantes, unités élémentaires utilisées pour construire tout organisme vivant et dont les interrelations en assurent le fonctionnement harmonieux.
En 1944, Avery, McLeod et McCarty assignèrent aux gènes une nature chimique précise : l’acide désoxyribonucléique ou ADN.
10 ans plus tard, une structure physique était proposée pour cet ADN par Watson et Crick. Cette découverte est le « caducée » le plus connu de la révolution biologique qui a débuté dans les années quarante.
Chaque brin de la double hélice est une chaîne de nucléotides, comportant une base choisie parmi quatre : l’Adénine (A), la guanine (G), la thymine (T) et la cytosine (C). La complémentarité chimique entre ces deux hélices permet de comprendre comment l’information génétique peut être fidèlement répliquée c’est à dire recopiée et transmise au cours des générations successives.
La double hélice d’ADN, telle que décrite par Watson et Crick et seule admise pendant 25 ans, connaît en fait bien des « avatars » au cours de la vie cellulaire.
Les découvertes successives mettent en évidence un fait nouveau : bien que la molécule d’ADN apparaisse plutôt inerte et rigide, elle s’avère une des molécules les plus variables tant du point de vue chimique que structural.
Sans remettre en cause le modèle de la double hélice et l’appariement des bases, de A avec T, de G avec C, la structure locale (pas de l’hélice, inclinaison des bases par rapport à l’axe de l’hélice, forces de liaisons,…) varie et l’ADN prend de nombreuses configurations comme le B-DNA à hélice droite et 10 paires de bases par tour de spire, le plus courant, l’A-DNA toujours à hélice droite mais à 8 paires de bases par tour, à grand sillon plus profond, et le Z-DNA, ou ADN en zig-zag à spirale gauche.
Ces différences pourront donc être reconnues de l’extérieur par toute molécule qui interagit avec l’ADN, et notamment par les systèmes enzymatiques complexes impliqués dans la réplication et l’expression des gènes, non seulement en fonction de la nature des bases, mais aussi de la géométrie de la configuration et du squelette de la molécule.
De plus, ces différentes structures ne doivent pas être considérées comme figées ; la double hélice est en fait le siège de mouvements incessants. Les plus rapides de l’ordre de la picoseconde (1 millionième de millionième de seconde) mettent en jeu des déformations de certaines liaisons au sein de l’ossature de chacune des chaînes de l’ADN. Des mouvements beaucoup plus lents se produisent au niveau des paires de bases A-T et G-C qui s’ouvrent et se ferment dans des domaines de temps qui s’étalent du millième de seconde à l’heure, en fonction de la structure locale adoptée par l’ADN.
La double hélice d’ADN « respire ». Loin d’être anecdotiques, ces avatars peuvent être impliqués à différentes étapes de la réplication de l’ADN et de l’expression des gènes.
Pour une molécule qui s’approche à la recherche d’un site de fixation, la molécule d’ADN n’apparaît pas comme une surface lisse et inerte, mais comme un objet présentant beaucoup d’aspérités et se déformant sans cesse.
Dans le noyau d’une cellule eucaryote, la longue molécule d’ADN (chez l’homme 1 m) doit résoudre un problème d’encombrement.
La double hélice s’enroule autour de globules protéiques, composés de protéines particulières, les histones. Les unités ainsi constituées, les nucléosomes, donnent à la chromatine l’allure d’un collier de perles au microscope électronique.
Dans les chromosomes, la chaîne des nucléosomes est de plus enroulée sur elle-même pour former des sortes de solénoïdes qui, à leur tour, s’organisent en structures très compactes.
Laissons admirer l’image 3D de l’ADN et d’un chromosome
Parallèlement à ces découvertes sur la nature chimique et la structure de l’ADN, de nombreux travaux (Ephrusi, Beadle et Tatum) devaient imposer l’idée, peu avant la seconde guerre mondiale, que les « produits » des gènes sont des protéines. Le gène porte donc l’information nécessaire pour que la cellule puisse accomplir une réaction donnée grâce à la fabrication de la protéine (enzyme) correspondante. Il fallut alors attendre les années 1960 pour que soit déchiffré le mécanisme complexe qui permet à la cellule de décoder l’information contenue dans l’ADN, pour la traduire sous forme de protéines : le code génétique.
Le génome est donc responsable de deux aspects primordiaux de la vie cellulaire :
· La multiplication cellulaire par réplication de l’ADN et division cellulaire
· La différenciation cellulaire par expression et transcription de certains gènes
Ceci est resté jusqu’en 1970 et la mise en évidence de la Transcriptase inverse le Dogme Central de la biologie

Une cellule vivante n’exprime cependant pas à un instant donné tous les gènes dont elle dispose. Chez les organismes supérieurs, les cellules remplissent d’ailleurs des fonctions très différentes selon l’organe dans lequel elles sont localisées (foie, cœur, cerveau,…).Pourtant elles renferment toutes la même information génétique, le même ADN.
Dans l’exemple de la cellule souche de la moelle osseuse, par différenciation, la même cellule d’origine va pouvoir produire des cellules spécialisées, libérant des cytokines variées, à fonctions différentes comme les hématies, les plaquettes, les divers groupes et sous-groupes de leucocytes, les macrophages.
La division cellulaire est nécessaire pour qu’un organisme vive. En fait, chez un homme adulte, des millions de cellules se divisent toutes les secondes pour le développement et la croissance, l’autoréparation et cicatrisation, la reproduction.
On appelle mitose la division d’une cellule eucaryote en deux cellules filles dont chaque noyau possède le même nombre et les mêmes types de chromosomes que ceux de la cellule mère.
Bien que la mitose soit un phénomène continu, on la divise arbitrairement en quatre phases : la prophase, la métaphase, l’anaphase et la télophase. L’intervalle séparant deux divisions se nomme interphase.
Prophase : La chromatine commence à se raccourcir, à s’épaissir et à se transformer en chromosomes distincts. Les paires de centrioles regroupés à un pôle du noyau commencent à se séparer l’un de l’autre en laissant apparaître entre elles les fibres du fuseau. Chaque paire s’entoure d’un ensemble de fibres radiales courtes, l’aster. L’enveloppe nucléaire disparaît.
Métaphase : Les chromosomes s’accrochent par leurs centromères à l’équateur du fuseau.
Anaphase : Les centromères se divisent, ce qui permet aux chromatides de se séparer et de migrer, par rétraction des fibres fusoriales, vers les pôles opposés du fuseau. Les chromatides prennent alors le nom de chromosomes.
Télophase : une enveloppe se forme autour des chromosomes de chaque cellule-fille. Ces chromosomes se déroulent et repassent à l’état de chromatine diffuse. S’en suit le clivage du cytoplasme.

L’organisme sain (30 milliards de cellules) est une communauté complexe, d’intérêt commun, ou chaque groupe de cellules règle la prolifération des autres. Cette collaboration incessante garantit à chaque tissu ou organe une taille et une structure adaptées.
Il fallait comprendre comment est réalisé ce contrôle ou régulation de l’expression des gènes. Cette régulation de l’expression génétique commande les grandes réponses biologiques comme la différenciation des cellules, l’embryogénèse, le développement de l’organisme, l’apparition des tumeurs,…
Dans les années cinquante, a été créée la notion de cycle cellulaire comprenant lui-même quatre phases :
G1 : (Growth) la cellule augmente de taille, et les organites cytoplasmiques se dédoublent.
S : (Synthèse) période pendant laquelle la réplication de l’ADN est effective
G2 : synthèse de différentes enzymes ainsi que des protéines structurales
M : (mitose) phase de mitose et de cytocinèse
Et une phase G0, correspondant à l’interphase, nullement phase de repos, mais plutôt phase d’intense activité.

La régularité de ce cycle est sévèrement contrôlée.
1. Sous l’influence de facteurs de croissance, la cellule reçoit au niveau d’un récepteur de la membrane cytoplasmique le signal de division.
2. Transmission du signal
3. la cellule sort de G0 et progresse au-delà du point de restriction
4. si elle reçoit un stimulus constant
5. Point de contrôle ne laissant se diviser que le DNA normal
6. Cellule double sa quantité de DNA par réplication
7. Apoptose ou suicide cellulaire en cas d’anomalie
8. Point de contrôle avant séparation du matériel génétique vers les deux cellules-filles, c’est la mitose. Les cellules filles se séparent et retournent en G0, sauf si un stimulus entretient le processus de division.

S’il y a un problème de communication, si la cellule ne répond plus ou répond mal aux signaux qui contrôlent la division, elle devient potentiellement cancéreuse.
La cellule cancéreuse est caractérisée :
- par sa prolifération anarchique par augmentation de la réplication de son ADN
- par la synthèse à partir de gènes mutés de protéines anormales et perte de production de protéines spécifiques du tissu
- par sa dédifférenciation par réactivation de certains gènes impliqués dans le développement embryonnaire (marqueurs tumoraux)

Pour rappel, les différents groupes de médicaments antitumoraux classiques et leurs places dans le cycle.

Dans le contexte des théories en cours, il semble évident d’expliquer ces caractéristiques par les mutations, donc de la structure primaire de l’ADN, la séquence des dinucléotides.
Le développement tumoral commence quand une cellule d’une population normale subit une mutation génétique qui déclenche sa prolifération, alors qu’elle ne devait pas se diviser.

La cellule modifiée et ses cellules filles gardent un aspect normal, mais se reproduisent trop vite : c’est la phase d’hyperplasie. Quelques années plus tard, une de ces cellules subit une nouvelle mutation qui endommage davantage le système de régulation de la croissance.

La descendance de cette cellule prolifère anormalement : les cellules filles ont une taille et une croissance anormales : c’est la phase de dysplasie. Puis une fois de plus, après quelques temps, une nouvelle mutation perturbe le comportement cellulaire.

Les cellules filles ont un aspect de plus en plus anormal. Tant que la tumeur n’a pas encore franchi les limites du tissu où elle a pris naissance, c’est un cancer in situ. Cette tumeur peut rester confinée indéfiniment, mais une de ces cellules peut aussi acquérir des mutations supplémentaires.

Quand ces nouvelles mutations permettent aux cellules tumorales d’envahir les tissus sous jacents et d’atteindre le sang ou la lymphe, la tumeur devient maligne. De nouvelles tumeurs, ou métastases apparaissent dans tout l’organisme. Quand une de ces tumeurs bloque le fonctionnement d’un organe vital, le pronostic vital est menacé.

Pourtant, l’analyse comparative des séquences nucléotidiques d’ADN sains et cancéreux correspondants, à laquelle les avancées techniques conférent une précision croissante, ne mettait pas en évidence l’existence constante de différences significatives entre les structures primaires de cet ADN. On ne peut identifier aucun gène propre à développement cancéreux et toute protéine synthétisée dans une tumeur peut l’être dans une cellule normale.

Il a été démontré qu’au moment de la réplication de l’ADN, ses deux brins doivent s’écarter l’un de l’autre. Les liaisons hydrogène se rompent, la chaîne s’ouvre localement, ce qui permet à l’ADN polymérase d’avoir accès aux sites d’initiation à partir desquels se fait la synthèse d’un nouveau segment d’ADN. L’ADN cancéreux est déstabilisé et offre plus de sites de réplication.

L’ADN a la propriété d’absorber la lumière ultraviolette d’une longueur de 260 nanomètres.
(Les purines (A,G) et les pyrimidines (T,C,U) de l’ADN et de l’ARN sont des composés faiblement basiques (bases) mais fortement conjugués, la ou les doubles liaisons sont partagées par les différents atomes du cycle de la molécule aromatique. Cette conjugaison a pour conséquence que toutes ces bases absorbent la lumière dans l’UV

Chaque désoxyribonucléotide présente un spectre d’absorption qui lui est propre, voisin de 260 nm. Dans l’ADN, les liaisons hydrogène entre bases entassées dans la structure du polymère (2 liaisons entre A et T, 3 liaisons entre G et C) ont pour effet de diminuer l’absorption UV par rapport à une solution ayant la même concentration de nucléotides libres.
L’ouverture d’une chaîne par la rupture d’une liaison hydrogène se traduit au spectrophotomètre par une absorption accrue. Cette hyperchromicité augmente en fonction de l’écartement des brins ou la déstabilisation de l’ADN. Une destruction complète des liens Hydrogène par la potasse KOH séparent les 2 chaînes au maximum, on observe alors une hyperchromicité maximale ; 45 à 55 % par rapport à l’ADN sous sa forme stable, resserrée.
On peut ainsi mesurer le degré de déstabilisation de l’ADN et l’action de molécules cancérigènes ou toxiques, déstabilisantes et des molécules stabilisatrices à action thérapeutique.

C’est à partir du postulat que les substances cancérigènes, en déstabilisant l’ADN, stimulent fortement la réplication de l’ADN cancéreux, alors qu’elles stimulent très faiblement les cellules saines, que Beljanski a mis au point en 1976 l’Oncotest.

Il opère in vitro sur des ADN purifiés d’origine humaine (biopsie et prélèvement peropératoire) d’organes sains (poumon, sein, ovaire, cerveau) et d’organes cancéreux correspondants.
Ces ADN sont incubés dans les mêmes conditions, dans un milieu contenant de ladésoxyribonucléotide-5’-triphosphate marquée à la thymidine tritiée, qui va être le marqueur de la synthèse de l’ADN donc de sa réplication et une ADN polymérase ADN dépendante extraite d’Escherichia Coli.

La sensibilité du test est excellente. Il peut être utilisé en recherche pour la mise au point d’anticancéreux spécifiques. Dans certains cas, il a donné des réponses positives pour des substances considérées comme dépourvues de potentialités cancérogènes, ce qui a conduit à détecter des impuretés en quantités minimes mais dangereuses, dans des extraits phytothérapiques utilisés.

L’événement auquel nous allons assister maintenant est la réplication de l’ADN. Beaucoup des événements qui se passent alors ne nous sont connus que par leur résultat. Ils sont profondément cachés à l’observation, sauf au niveau du réplisome. Nous avons maintenant une assez bonne idée de ce qui se passe à l’intérieur.

Le processus de réplication débute de manière symétrique sur les deux brins en partageant leur polarité antiparallèle.
L’initiation implique la participation de protéines spéciales, les initiateurs et met en œuvre deux événements distincts :

- la séparation des brins, qui nécessite l’intervention de toutes une série d’enzymes

- l’amorçage, effectué par un type spécial d’ARN polymérase, la primase, qui fabrique un court segment d’ARN (9 à 10 nucléotides) complémentaire sur chaque brin. Cet ARN amorceur va jouer un rôle essentiel, l’ADN-polymérase étant incapable de commencer une chaîne d’ADN de novo.

Les topoisomérases sont chargées d’introduire des supertours négatifs à chaque extrémité de la bulle de réplication, diminuer ainsi le degré de surenroulement de l’hélice et permettre l’ouverture et la progression de la bulle.
La topoisomérase I ne coupe qu’un brin de la double hélice, la topoisomérase de type II coupe simultanément les 2 brins.

Suit alors l’action de l’hélicase, qui avec l’appoint des protéines de liaisons simple brin (SSB) va entraîner la séparation, la linéarisation et la fixation de la déstabilisation du simple brin de l’ADN matrice. Les polymérases peuvent alors seulement agir.

L’amorçage est effectué par la primase, type spécial d’ARN-polymérase, qui va apparier à l’ADN parental un court fragment amorceur d’ARN (9-10 nucléotides). La réplication se poursuivra alors normalement par l’intervention de l’ADN-polymérase.
Les différents segments sont réunis par une ligase.

La toxicité, notamment au niveau de la moelle osseuse, de la chimiothérapie et de la radiothérapie, est la cause d’un sévère déséquilibre du système sanguin, avec ses conséquences infectieuses, hémorragiques,…
Il était essentiel de trouver des amorceurs ARN spécifiques stimulant la réplication de l’ADN de moelle osseuse et des cellules hématopoiétiques. Ces ARN-fragments (RLB ou REAL BUILT) ont été obtenus par découpage en fragments courts, à l’aide d’une ribonucléase pancréatique, de l’ARN ribosomique d’E.Coli, bactérie facile à cultiver.
Il semble que ces substances correspondent à une voie utilisée par l’organisme en réponse à des stimulations variées pour agir dans des réactions biochimiques bien définies.

Les ARN-fragments ont été utilisés chez des animaux de laboratoire préalablement traités par diverses chimiothérapies afin de provoquer des pertes mortelles de lignées de leucocytes ou de plaquettes. En présence d’ARN-fragments spécifiques, ces animaux restauraient un taux normal de leucocytes, ainsi qu’un équilibre entre les diverses lignées de globules blancs et un taux normal de plaquettes, qui leur permettait de survivre.

L’ADN cancéreux répondant si facilement aux agents déstabilisants, on pouvait supposer qu’il répondait également à des molécules agissant en sens inverse, qui se comporteraient comme des molécules-verroux, rapprochant et restabilisant les brins séparés de la chaîne d’ADN.

Entre le chasseur tapi dans la brousse, prêt à décrocher une flèche empoisonnée et le pharmacologue travaillant à l’élaboration d’un nouveau médicament, il existe parfois un lien étroit. Il n’est pas rare que le second suive la direction indiquée par le trait du premier.
Contre le cancer, suivez la flèche, article du journal médical « Le généraliste » fait référence aux travaux des :
- Professeur Angenot (Ulg) sur les alcaloïdes indoliques de Strychnos usabaransis, tel la strycnopentamine, proche du taxol, à propriétés antiprolifératives
- Professeur Bassleer (ULg) qui a pu montrer que la strychnopentamine emprunte une voie originale, l’inhibition de la synthèse d’ARN, avec souffrance cellulaire et altérations morphologiques de la surface cellulaire.

En utilisant l’Oncotest, Beljanski a pu sélectionner des extraits de deux plantes, le Pao Pereira, un arbre de la forêt tropicale d’Amérique du Sud, et le Rauwolfia Vomitoria, une plante africaine. Ces deux extraits végétaux, la flavopereirine et l’alstonine, se comportent comme des anticancéreux spécifiques.

Les cellules cancéreuses montrent des caractéristiques particulières dont :

- une diminution d’adhérence au substrat
- une morphologie moins aplatie
- une perte d’inhibition de contact
- une prolifération en présence de faibles quantités de facteurs de croissance
- la formation de tumeurs si greffées
- et une polarisation inversée de la membrane cellulaire

Cette différence de potentiel membranaire entre cellules saines et cellules cancéreuses explique, dans le cas des cellules saines, la fixation des extraits de flavopereirine ou d’alstonine à l’extérieur de la membrane cytoplasmique, et le franchissement de celle-ci et la pénétration dans le noyau des cellules cancéreuses, où ils vont pouvoir agir.

Hypothèse toute personnelle de cette action par neutralisation et inactivation des protéines SSB et perte de la linéarité et restabilisation de l’ADN, empêchant l’action de l’ADN polymérase.

Dr. Pierre Umé (2003)
Docteur en Médecine (Ulg)
Licence spéciale en Biologie moléculaire (ULB)